Cloroplastos al microscopio

Con un microscopio óptico escolar a 400 aumentos se ven perfectamente: óvalos verdes de unas cinco micras, sin teñir, alineados junto a la pared de cada célula. Lo que no se ve con ningún microscopio óptico son las granas, los tilacoides, la doble membrana ni ninguna de las estructuras internas, y no es cuestión de comprar un aparato mejor: es un límite físico de la luz.

Todo lo que se puede o no se puede observar de un cloroplasto se deduce de una sola cifra. El poder de resolución de un microscopio óptico está en torno a 200 nanómetros, y un tilacoide mide 7. La diferencia es de casi treinta veces, así que ninguna óptica convencional los separará jamás.

Esta página cubre las tres cosas que hacen falta para trabajar con imágenes de cloroplastos: qué muestra cada instrumento y hasta dónde llega, cómo montar una preparación que salga bien, y cómo interpretar una micrografía sin confundir un artefacto del procesado con biología.

Por qué 200 nanómetros y no menos

Dos puntos muy próximos dejan de distinguirse cuando sus imágenes se solapan por difracción. Ernst Abbe formuló el límite en 1873: la distancia mínima resoluble es aproximadamente la longitud de onda dividida entre el doble de la apertura numérica del objetivo. Con luz visible de unos 550 nanómetros y un objetivo de inmersión bueno, con apertura 1,4, sale algo por debajo de 200 nanómetros.

De ahí se deriva otra consecuencia práctica: por encima de unos 1.000 o 1.500 aumentos, un microscopio óptico solo da imagen más grande, no más detallada. Es lo que se llama aumento vacío, y explica por qué los microscopios de juguete que anuncian 1.200 o 2.000 aumentos no muestran nada que no se viera a 400.

Qué muestra cada objetivo del microscopio óptico

40 aumentos (objetivo de 4x). Sirve para localizar la muestra y encuadrar. Las células se distinguen apenas y el verde aparece como una masa uniforme. Es el objetivo con el que hay que empezar siempre a enfocar.

100 aumentos (10x). Se resuelve el contorno de cada célula y se aprecia que el verde está repartido en granos, sin poder contarlos.

400 aumentos (40x). Es el aumento de trabajo. Se cuentan los cloroplastos de una célula, se aprecia su forma lenticular, se ve que están en la periferia y se sigue su desplazamiento con la corriente citoplásmica. Para prácticamente cualquier pregunta escolar sobre cloroplastos, este es el objetivo.

1.000 aumentos (100x de inmersión en aceite). Añade poco en una preparación en fresco de hoja, porque el grosor del tejido dificulta el enfoque y la profundidad de campo es mínima. Aporta más en preparaciones muy finas, como algas filamentosas de una sola capa celular.

Una ventaja que casi ninguna otra estructura celular tiene

El cloroplasto es de los pocos orgánulos que se observan sin teñir. Tiene color propio y absorbe luz, de modo que en campo claro genera contraste por sí mismo. Un aparato de Golgi o un retículo endoplasmático son transparentes y requieren tinción o técnicas especiales; un cloroplasto no.

Aun así, hay técnicas ópticas que mejoran la observación. El contraste de fases convierte diferencias de índice de refracción en diferencias de brillo, y resulta útil para ver a la vez el cloroplasto y las estructuras incoloras que lo rodean: núcleo, pared, tonoplasto. El campo oscuro ilumina de forma oblicua y la muestra aparece brillante sobre fondo negro, muy vistoso con algas unicelulares. Y el contraste interferencial de Nomarski da una imagen con apariencia de relieve: es el que produce las micrografías de aspecto tridimensional que aparecen en los manuales.

Fluorescencia: la clorofila se delata sola

Aquí hay una particularidad que conviene conocer porque simplifica mucho el trabajo. La clorofila es autofluorescente: excitada con luz azul, en torno a 450 nanómetros, emite en el rojo profundo, hacia 680. No hace falta ningún colorante.

Un microscopio de fluorescencia muestra los cloroplastos como puntos rojos intensos sobre fondo negro, con un contraste que ninguna técnica de campo claro alcanza. Es la manera estándar de contarlos, de medir su distribución dentro de la célula y de seguir su reubicación en respuesta a la luz.

Añadiendo un microscopio confocal, que descarta la luz procedente de planos fuera de foco, se obtienen secciones ópticas del tejido y se puede reconstruir la célula en tres dimensiones. Es también con esta técnica como se han visto los estrómulos, las prolongaciones tubulares del orgánulo, que en campo claro pasan completamente desapercibidas.

Un aviso experimental: la autofluorescencia de la clorofila es tan intensa que interfiere con casi cualquier marcador fluorescente rojo que se quiera usar en tejido vegetal. Es un incordio conocido en los laboratorios de biología vegetal.

Qué material elegir para una preparación en fresco

La preparación que mejor funciona se monta en menos de dos minutos y no necesita ningún reactivo: una hoja pequeña de Egeria densa, la planta de acuario, colocada entera sobre el portaobjetos con una gota de agua y tapada con un cubreobjetos. A 400 aumentos aparecen decenas de cloroplastos por célula, nítidos, verdes y moviéndose.

El motivo por el que sale tan bien es que sus hojas tienen solo dos capas de células y son transparentes. La mayoría de los fracasos en esta práctica vienen de elegir material demasiado grueso: una hoja de geranio o de laurel no deja pasar la luz y en el microscopio se ve una mancha oscura.

Una advertencia responsable sobre la primera: tanto Egeria densa como Elodea canadensis son plantas acuáticas exóticas con carácter invasor en España, capaces de colonizar canales y embalses a partir de fragmentos muy pequeños. No deben verterse restos ni agua de acuario a desagües, arroyos ni estanques. Lo sobrante se tira a la basura después de dejarlo secar.

Protocolo 1: hoja de Egeria, paso a paso

1. Elige una hoja joven del extremo del tallo, de las pequeñas y de verde claro. Las viejas están más engrosadas y suelen tener epífitos encima.

2. Deposita una gota de agua del propio acuario en el centro del portaobjetos. Agua del acuario, no del grifo: el cloro y el cambio de composición estropean la observación del movimiento.

3. Coloca la hoja entera sobre la gota, sin cortarla ni aplastarla. No hace falta ningún corte.

4. Apoya un borde del cubreobjetos junto a la gota, en ángulo de unos 45 grados, y déjalo caer despacio. Así el líquido avanza empujando el aire y no quedan burbujas.

5. Retira el exceso de agua tocando el borde del cubre con la esquina de un papel de filtro.

6. Empieza a enfocar con el objetivo de 4x, sube a 10x y termina en 40x. En 40x solo se toca el tornillo micrométrico, nunca el macrométrico: es la forma más frecuente de romper una preparación y rayar el objetivo.

7. Cierra parcialmente el diafragma. Con demasiada luz el verde se lava y los cloroplastos pierden contraste.

Del enfoque salen ya varias observaciones: los cloroplastos están pegados a la pared y no en el centro de la célula, forman una capa única, y en la mayoría de las hojas se aprecia que circulan siguiendo un recorrido cerrado.

Protocolo 2: musgo, la preparación más limpia

Los filidios de muchos musgos (las estructuras que parecen hojas) tienen una sola capa de células salvo en el nervio. Eso los convierte en el mejor material posible para ver la forma individual de cada cloroplasto sin superposiciones.

Basta con arrancar una ramita, separar con pinzas dos o tres filidios, montarlos en agua y observar. Si el musgo estaba seco, conviene rehidratarlo cinco o diez minutos en agua antes: el musgo desecado se recupera y sus células recobran turgencia, lo que en sí mismo es una demostración interesante.

Funaria hygrometrica, frecuente en zonas quemadas y en macetas, y los musgos del género Plagiomnium, de filidios grandes y traslúcidos, funcionan especialmente bien.

Protocolo 3: epidermis con estomas

Sirve para ver algo distinto: que la epidermis normal no tiene cloroplastos y que las células oclusivas del estoma sí. El contraste es muy didáctico.

La técnica es el arrancado. Se dobla una hoja de Tradescantia o de lirio hasta partirla por el envés y se tira despacio de uno de los trozos en paralelo a la superficie; se desprende una lámina finísima y transparente. Se monta en agua.

Lo que aparece son células epidérmicas grandes, incoloras y de contorno ondulado, y entre ellas, pares de células con forma de riñón que delimitan un poro y que llevan cloroplastos pequeños y bien visibles, del orden de una decena por célula. Son las únicas células verdes de toda la epidermis.

Existe también la técnica del esmalte de uñas, que consiste en pintar el envés, dejar secar y despegar la película con cinta adhesiva. Da un molde excelente de la forma y la densidad de los estomas, pero no sirve para este objetivo: es una impresión de la superficie y no contiene células ni cloroplastos.

Protocolo 4: Spirogyra

Si se consigue agua verdosa de una charca, merece la pena buscar filamentos resbaladizos al tacto. Basta con montar unos pocos en una gota de la misma agua.

El interés es morfológico: cada célula tiene uno o varios cloroplastos en forma de cinta que recorre la célula describiendo una hélice, con engrosamientos regulares llamados pirenoides donde se acumula almidón. Es la mejor manera de comprobar que la forma de lente de las plantas terrestres no es la única posible.

Qué material evitar

La epidermis de cebolla. Es la preparación estrella de cualquier laboratorio escolar y no tiene un solo cloroplasto: sus plastos son leucoplastos incoloros. Vale para pared, núcleo y plasmólisis; no vale para esto.

Hojas gruesas, coriáceas o carnosas. Laurel, adelfa, ficus, aloe: demasiado espesor, no pasa la luz.

Hojas con muchos tricomas. Los pelos atrapan aire y llenan el campo de burbujas.

Material machacado. Aplastar la hoja con el mango del bisturí revienta las células y deja cloroplastos sueltos por el medio: se ven, pero se pierde toda la información de contexto y el movimiento cesa.

Tinciones y variantes que sí aportan algo

Ninguna, para ver el cloroplasto. Tiene color propio y cualquier tinción lo empeora. Es una de las pocas estructuras celulares que se observan en fresco sin más.

Lugol, para ver almidón. Tiñe de azul muy oscuro, casi negro, los granos de almidón del estroma. Comparando una hoja de una planta que ha estado 48 horas a oscuras con otra iluminada durante el día se aprecia la diferencia con claridad. Sobre hoja entera hay que retirar antes la clorofila hirviendo en alcohol, pero en una preparación de Egeria a veces se distinguen los granos directamente.

Solución salina, para provocar plasmólisis. Añadiendo por un borde del cubreobjetos una gota de disolución de sal o de azúcar al 5 o 10 % y absorbiendo por el otro con papel de filtro, el protoplasto se retrae y se separa de la pared. Los cloroplastos se van con él, arrastrados hacia el interior, y queda a la vista que la pared es una estructura independiente y que no todo lo que se ve del contorno celular es membrana. Añadiendo después agua, el proceso se revierte en muchos casos.

Qué medir y observar en la misma sesión

Contar cloroplastos por célula. Con paciencia y jugando con el micrométrico para recorrer los distintos planos de la célula. En Egeria salen del orden de varias decenas.

Estimar su tamaño. Un ocular de 10x con un objetivo de 40x da un campo de visión de unos 0,45 milímetros de diámetro. Contando cuántos cloroplastos caben alineados en el diámetro del campo y dividiendo se obtiene una estimación razonable, que debería rondar las 5 micras.

Medir la corriente citoplásmica. Se cronometra cuánto tarda un cloroplasto en recorrer la longitud de una célula. Es una buena práctica cuantitativa, y se puede repetir tras dejar la preparación unos minutos bajo la luz de la lámpara: el flujo se acelera al subir ligeramente la temperatura, y se frena si la preparación se enfría.

Observar la posición. Comprobar que los cloroplastos se disponen contra la pared y no rellenan la célula, lo que evidencia el volumen que ocupa la vacuola.

Problemas frecuentes

Dos advertencias sobre lo que se ve

No todo lo verde y redondo es un cloroplasto. Burbujas de aire atrapadas bajo el cubreobjetos, granos de almidón sueltos y restos de tejido machacado despistan con frecuencia. El criterio fiable es el conjunto: color verde propio, forma lenticular, tamaño uniforme de unas cinco micras y disposición ordenada dentro de una célula con pared reconocible.

El movimiento que se ve no es la respuesta a la luz. Lo que circula describiendo un recorrido cerrado es la corriente citoplásmica, que arrastra los cloroplastos como pasajeros. La reubicación fotoinducida, guiada por fototropinas, tarda entre diez minutos y una hora y no se aprecia en una sesión de prácticas. Confundir ambas es el error más habitual en los informes.

Aislar cloroplastos y verlos sueltos

Hay una variante que va más allá de la observación en fresco y que se puede hacer con una batidora doméstica y una centrifugadora de laboratorio escolar: separar los cloroplastos del resto de la célula y trabajar con ellos.

1. Espinacas frescas, sin nervios gruesos. Todo el material y todos los líquidos, fríos: cubeta con hielo desde el principio.

2. Triturar unos 20 gramos de hoja con un tampón frío que contenga un azúcar como el sorbitol para mantener la presión osmótica. Batir en pulsos muy cortos, de tres a cinco segundos: pasarse de tiempo rompe los orgánulos.

3. Filtrar por varias capas de gasa para retirar restos de tejido.

4. Centrifugar suave, en torno a 200 g durante un minuto, y descartar el sedimento, que son fragmentos de pared y células enteras.

5. Centrifugar el sobrenadante más fuerte, unos minutos a 1.000-3.000 g. El sedimento verde intenso es la fracción de cloroplastos.

6. Resuspender en un poco de tampón frío y mantener en hielo y a oscuras hasta usarlo.

Una gota de esa suspensión al microscopio muestra cloroplastos sueltos y perfectamente reconocibles. Es también la manera de comprobar su fragilidad: en agua destilada revientan por ósmosis en segundos y el verde se difunde.

La reacción de Hill: comprobar que funcionan

Con esa suspensión se puede repetir el experimento que en 1937 demostró que el oxígeno de la fotosíntesis procede del agua y no del CO₂.

Se añade a los cloroplastos aislados un colorante azul, el DCPIP, que actúa de aceptor artificial de electrones y que se vuelve incoloro al reducirse. Al iluminar el tubo, el azul desaparece en cuestión de minutos. La cadena de transporte de electrones está funcionando: hay electrones arrancados al agua que llegan al colorante.

Los controles son la mitad del valor de la práctica. Un tubo idéntico envuelto en papel de aluminio permanece azul, lo que demuestra que el proceso depende de la luz. Otro tubo con la suspensión previamente hervida también permanece azul, lo que demuestra que hacen falta proteínas intactas y no basta con el pigmento. Y como en ningún momento se ha añadido CO₂, la conclusión es directa: la fase luminosa no lo necesita, tal como se explica en función de los cloroplastos.

El microscopio electrónico de transmisión: todo lo que sabemos del interior

Prácticamente toda la anatomía interna descrita en los cloroplastos procede de esta técnica. En lugar de luz utiliza un haz de electrones, cuya longitud de onda asociada es minúscula, y alcanza en muestras biológicas una resolución del orden de 2 nanómetros o mejor.

El precio es que la muestra tiene que estar muerta, fijada, deshidratada, incluida en resina, cortada en secciones de 60 a 90 nanómetros y contrastada con sales de metales pesados. Nada de eso es compatible con observar un proceso vivo, y hay que tener presente que lo que se ve es un corte plano de un objeto tridimensional: unas granas cortadas de canto y otras de plano dan imágenes muy distintas del mismo orgánulo.

Lo que muestra: las dos membranas de la envoltura como líneas paralelas, las pilas de tilacoides con sus discos individuales, las lamelas que las conectan, los granos de almidón como zonas claras y sin estructura, los plastoglóbulos como puntos oscuros y densos, y los nucleoides de ADN como regiones fibrilares claras.

Barrido y criofractura

El microscopio electrónico de barrido no atraviesa la muestra: recorre su superficie y produce imágenes de aspecto tridimensional. No es la herramienta para el interior de un cloroplasto, pero sí para ver la superficie de una hoja, los estomas y la disposición del tejido.

La criofractura merece un párrafo aparte por su valor histórico. Consiste en congelar la muestra a temperatura de nitrógeno líquido y romperla; la fractura tiende a propagarse por el interior hidrófobo de las membranas, y las separa en dos mitades exponiendo sus caras internas. Sobre esas caras se ven partículas que corresponden a complejos proteicos individuales.

Fue así como se comprobó que las partículas grandes, correspondientes al fotosistema II, se concentran en las membranas apiladas de las granas, mientras que las lamelas del estroma llevan otras distintas. La heterogeneidad lateral de la membrana tilacoidal no se dedujo: se vio.

Lo que se usa hoy en investigación

Criomicroscopía electrónica. Congela la muestra tan deprisa que el agua no cristaliza, y evita fijadores y deshidratación. Ha permitido resolver la estructura atómica de los complejos fotosintéticos completos, con sus centenares de clorofilas colocadas una a una.

Tomografía crioelectrónica. Toma imágenes de la misma zona a distintos ángulos y reconstruye el volumen. Con ella se ha visto cómo se conectan las granas mediante rampas helicoidales, algo que las secciones planas no permitían decidir.

Microscopía de superresolución. Técnicas como STED o SIM burlan el límite de Abbe con trucos ópticos y llegan a 50 o 100 nanómetros trabajando con muestras vivas y fluorescentes. Es el terreno intermedio entre el microscopio óptico y el electrónico.

Microscopía de fuerza atómica. Recorre la superficie de una membrana tilacoidal aislada con una punta finísima y dibuja su relieve. Ha permitido ver cómo se empaquetan los complejos de antena unos junto a otros.

Qué instrumento para qué pregunta

Leer una micrografía: lo primero, ahí no hay color

Una micrografía electrónica de cloroplasto y el esquema de un libro se parecen menos de lo que sugiere ponerlos uno al lado del otro. La fotografía es una lámina de 60 a 90 nanómetros de grosor, en escala de grises, tomada de una muestra muerta, fijada, deshidratada y contrastada. El esquema es una reconstrucción idealizada de un objeto tridimensional completo y vivo.

Un microscopio electrónico no registra color porque no usa luz. Lo que mide es cuántos electrones atraviesan cada punto de la sección: donde hay más densidad electrónica pasan menos y el punto sale oscuro. La imagen original es siempre en grises.

Y esa densidad la fabrica el técnico. Las membranas no son intrínsecamente oscuras: se ven así porque el tetróxido de osmio y las sales de uranio y plomo que se usan para contrastar se fijan preferentemente a los lípidos y a las proteínas. Cambiando el protocolo de tinción cambia lo que destaca en la foto.

Cuando una micrografía aparece publicada en verde o en azul, el color se ha añadido después por ordenador, con fines divulgativos. Es legítimo y suele estar indicado con la expresión «color falso» o «coloreada digitalmente». Lo que no es legítimo es deducir nada del color: ni que ahí hubiera clorofila, ni que una zona sea más verde que otra.

Es un corte, y el corte decide lo que se ve

Un cloroplasto mide unas 5 micras, es decir, 5.000 nanómetros. Una sección ultrafina tiene entre 60 y 90. Haría falta apilar del orden de sesenta cortes para atravesar el orgánulo entero.

Lo que se ve en una fotografía es, por tanto, una rebanada, y su aspecto depende por dónde haya pasado el cuchillo:

Corte por el centro y en el eje largo. Es la imagen canónica: el orgánulo aparece como una lente, con la envoltura de dos líneas y las granas cortadas de canto en forma de pilas de rayas.

Corte por un extremo. El mismo cloroplasto aparece pequeño y casi circular. Es fácil confundirlo con otro orgánulo o creer que hay cloroplastos de tamaños muy distintos en la misma célula.

Corte que atraviesa una grana de plano. En lugar de rayas aparece una mancha oscura y homogénea, sin estructura visible. Es la misma grana vista desde otro ángulo, y despista bastante.

La consecuencia general es que a partir de una sola sección no se pueden sacar conclusiones sobre la forma tridimensional. Para eso se recurre a la tomografía electrónica.

Guía para identificar cada estructura

El almidón claro sorprende a quien espera que lo denso salga oscuro. La explicación es de tinción: los polisacáridos apenas fijan las sales de metales pesados, así que quedan pálidos aunque sean estructuras compactas.

La barra de escala: leerla antes que la imagen

Una micrografía sin barra de escala es prácticamente inútil, porque el aumento es arbitrario. Con barra, la lectura es inmediata: si la barra indica 500 nanómetros y el cloroplasto mide diez veces esa barra, el orgánulo tiene 5 micras.

Como referencia de qué aumento corresponde a cada nivel de detalle: entre 3.000 y 10.000 aumentos se ve la célula o varios orgánulos a la vez, con las granas reconocibles como bloques oscuros. Entre 10.000 y 30.000, un cloroplasto llena el encuadre y se distinguen los tilacoides individuales de cada pila. Por encima de 50.000, se separan las dos membranas de la envoltura y se aprecia el lumen de cada tilacoide como una línea clara entre dos oscuras.

Artefactos: lo que está en la foto pero no estaba en la célula

Preparar una muestra para microscopía electrónica implica matarla, deshidratarla e incluirla en resina, y cada paso deja huella. Reconocer esas huellas evita interpretarlas como biología:

Rayas paralelas y rectas que cruzan toda la imagen. Marcas del cuchillo del ultramicrotomo. Atraviesan la resina y los tejidos por igual, sin respetar ninguna estructura, y eso las delata.

Manchitas negras irregulares repartidas al azar. Precipitados del contraste de plomo. Están también sobre el fondo de resina, fuera de la célula.

Pliegues. Bandas onduladas más oscuras: la sección se ha arrugado al recogerla sobre la rejilla.

Retracción del estroma. Huecos vacíos entre el contenido y la envoltura, provocados por la deshidratación. En una célula viva no hay espacios así.

Tilacoides hinchados. Si la fijación fue lenta o el tampón inadecuado, el lumen aparece dilatado y las granas pierden regularidad. Con criofijación esto no ocurre, y es una de las razones por las que la criomicroscopía desplazó a los métodos clásicos.

Comparación entre los tres tipos de imagen

Imágenes de fluorescencia: el rojo que no es un color real

Hay un tercer tipo de imagen muy frecuente en publicaciones: fondos negros con puntos rojos intensos. Son los cloroplastos vistos por fluorescencia.

Ese rojo sí corresponde a una emisión real (la clorofila excitada con luz azul emite hacia 680 nanómetros), pero el color que aparece en pantalla lo asigna el software al canal correspondiente, y en una imagen compuesta puede haber otros canales superpuestos: verde para una proteína marcada, azul para el núcleo. Antes de interpretar una imagen así hay que leer el pie de figura y saber qué se ha asignado a cada canal.

Es también la técnica con la que se han fotografiado los estrómulos, esas prolongaciones tubulares del cloroplasto que en campo claro no se aprecian y que en fluorescencia aparecen como hilos rojos finísimos saliendo del orgánulo.

Cómo distinguir una foto real de una ilustración por ordenador

Buena parte de las imágenes que circulan con el rótulo de «cloroplasto al microscopio» son renders tridimensionales. No tienen nada de malo como material didáctico, pero conviene no confundirlos con datos. Señales que delatan un render:

Simetría perfecta y granas idénticas. En una muestra real ninguna grana se parece a la de al lado, y el contorno nunca es regular.

Iluminación con sombras y brillos. Un microscopio electrónico no produce reflejos especulares ni sombras proyectadas: eso es iluminación de escena renderizada.

Colores saturados y degradados suaves. Verde intenso con reflejos, típico de ilustración.

Ausencia de barra de escala y de artefactos. Una micrografía real casi siempre tiene alguna imperfección; una imagen perfecta y limpia es sospechosa.

Profundidad de campo tipo fotográfica. Un fondo desenfocado detrás del orgánulo no ocurre en una sección ultrafina.

Cuatro preguntas que hacerle a una imagen antes de usarla

¿De qué organismo es? Un cloroplasto de espinaca, uno de vaina del haz de maíz y uno de alga no se parecen. Sin esa información, la imagen no ilustra nada concreto.

¿Con qué técnica se obtuvo? Transmisión, criofractura, fluorescencia y barrido dan imágenes incomparables entre sí.

¿Cuál es el aumento o la barra de escala? Sin ese dato no se puede saber si se está mirando un orgánulo entero o el detalle de una sola grana.

¿De dónde procede y con qué licencia? Para uso escolar o divulgativo hay repositorios con imágenes de microscopía verificadas y de reutilización permitida. Copiar una imagen de un buscador sin comprobar el origen suele significar reproducir un render y atribuirle valor de fotografía.

Lectura guiada de una micrografía típica

Conviene practicar el orden de lectura, porque hacerlo al revés lleva a conclusiones equivocadas. Ante una micrografía electrónica de una célula del mesófilo, la secuencia razonable es esta.

Primero, la barra de escala. Antes que nada. Determina si lo que ocupa la mitad del encuadre es una célula, un orgánulo o una sola grana.

Segundo, localizar la pared celular. Aparece como una banda ancha, clara y sin membranas por dentro, situada entre dos células. Sirve de referencia para orientarse: todo lo que está a un lado pertenece a una célula y todo lo del otro a su vecina.

Tercero, identificar la vacuola. Es el gran espacio claro y homogéneo, limitado por una sola membrana. Ocupa la mayor parte del área, y comprobarlo confirma de un vistazo lo que dicen las cifras sobre el reparto de volumen.

Cuarto, contar las membranas de cada orgánulo. Este es el criterio decisivo para distinguirlos. Dos membranas y estructuras internas apiladas: cloroplasto. Dos membranas y pliegues que salen de la interna: mitocondria. Una membrana y contenido granular denso, a veces con un cristal: peroxisoma.

Quinto, buscar los vecinos. Si aparecen un cloroplasto, un peroxisoma y una mitocondria en contacto, no es casualidad de corte: es la agrupación funcional de la fotorrespiración.

Sexto, mirar lo que no debería estar. Rayas rectas que cruzan todo, precipitados oscuros sobre la resina, huecos de retracción. Reconocidos como artefactos, dejan de contaminar la interpretación.

Y para dibujarlo

Un esquema no es una fotografía, y conviene no mezclar los dos géneros. Un dibujo de observación al microscopio representa lo que se ve: células con pared y, dentro, puntos verdes lenticulares junto a la pared. Nada más. Dibujar granas, tilacoides o membranas en un dibujo de observación es falsear el resultado, porque a 400 aumentos esas estructuras no se resuelven, y se detecta al instante en un informe de prácticas.

El esquema teórico es otra cosa: muestra lo que se sabe, procede de microscopía electrónica y se traza en cinco pasos, con nueve partes rotuladas y una lista concreta de errores que evitar. Está desarrollado, con un esquema descargable ya trazado, en cómo dibujar un cloroplasto.

Qué se vio primero y cuándo

La historia de lo que se ha podido observar sigue exactamente la de los instrumentos disponibles, y ayuda a situar cada nivel de detalle.

1837. Hugo von Mohl describe los granos verdes del interior de las células vegetales con microscopios ópticos ya decentes. Se les llamará durante décadas «granos de clorofila», confundiendo el pigmento con el orgánulo.

1862. Julius von Sachs demuestra que los granos verdes acumulan almidón a la luz y lo pierden a oscuras, aplicando la tinción con yodo sobre hojas decoloradas. Es el primer experimento que asocia una estructura visible con una función química.

1883. Andreas Schimper acuña el término plastidio, observa que se dividen y que no se forman de nuevo, y sugiere ya que podrían tener un origen simbiótico. Todo eso con óptica de finales del siglo XIX.

1937. Robert Hill trabaja con cloroplastos aislados y demuestra que desprenden oxígeno sin CO₂. No es microscopía, pero marca el límite de lo que se podía deducir sin ver el interior.

Años cuarenta y cincuenta. Las primeras micrografías electrónicas revelan que los «granos» tienen dentro un sistema de membranas apiladas. El nombre de grana, que venía de la textura granulosa vista con luz, encuentra por fin su correspondencia estructural.

Años sesenta y setenta. La criofractura muestra los complejos proteicos individuales dentro de la membrana y establece que no están repartidos al azar.

Siglo XXI. La criomicroscopía resuelve la estructura atómica del fotosistema II con su racimo de manganeso, y la tomografía reconstruye en tres dimensiones cómo se conectan las granas.

En resumen

El microscopio óptico resuelve hasta unos 200 nanómetros, así que muestra el cloroplasto entero pero ninguna de sus estructuras internas. A 400 aumentos se ven la forma, el número, la posición periférica y el arrastre por la corriente citoplásmica, y todo ello sin teñir, porque el orgánulo tiene color propio. La mejor preparación es una hoja entera de Egeria densa montada en agua del propio acuario, sin cortes y con el diafragma medio cerrado; los filidios de musgo dan la imagen más limpia, y conviene evitar la epidermis de cebolla, que no tiene ningún cloroplasto.

Para el interior hace falta el microscopio electrónico de transmisión, que trabaja sobre secciones de 60 a 90 nanómetros de material muerto y contrastado con metales pesados. Sus imágenes son siempre en grises, el color se añade después, y el plano de corte determina lo que se ve: un mismo orgánulo puede parecer una lente con granas rayadas, un disco pequeño y redondo o una mancha sin estructura. Conviene leer siempre la barra de escala y reconocer los artefactos habituales antes de interpretar nada.